优化Tet-On系统用于iPSC均质成肌分化

　　

　　

　　

　　在最近发表在《iScience》上的一项研究中，研究人员优化了Tet-On系统，以提高从iPSCs生成骨骼肌细胞和其他分化细胞类型的效率，用于各种基础和临床研究目的。该团队由副教授Hidetoshi Sakurai(临床应用系)和副教授Knut Woltjen(生命科学前沿系)领导。

　　从诱导多能干细胞(iPSCs)中产生分化细胞和组织的研究人员面临的一个关键挑战是异质性。例如，未分化或部分分化细胞的污染分别导致疾病建模和细胞治疗的可重复性和安全性问题。

　　四环素诱导基因表达系统(Tet-On)是研究人员用来调节对强力霉素(一种常见抗生素)应答的转基因表达的基本遗传工具。具体来说，该系统是基于逆转录四环素激活因子(rtTA)结合Tet-On启动子的能力，Tet-On启动子由tet -操纵子重复序列和最小巨细胞病毒(CMV)启动子组成，只有在强力霉素存在的情况下才能激活外源基因表达。

　　它的易用性使研究人员能够将多能干细胞直接分化成各种细胞类型。然而，非均匀的转基因激活仍然是一个问题，因此研究人员必须评估和选择iPSC克隆，以确定有效和稳定地表达感兴趣的转基因的克隆。

　　为了解决异质性问题，研究人员首先回到基础上来确定转基因激活失败的根本原因。由于MYOD1过表达是诱导iPSCs向肌源性分化的首选诱导方法，研究人员首先检测了piggyBac转酶表达系统过表达MYOD1(与mCherry作为荧光报告蛋白平行指示MYOD1表达)、rtTA和新霉素(抗生素)抗性阳性选择标记物的能力。

　　在将piggyBac系统导入iPSCs并选择将该系统整合到其基因组中的细胞后，用强力霉素处理细胞以启动成肌分化。值得注意的是，研究人员发现并非所有细胞都表达MYOD1，这表明许多细胞未能开启转基因。

　　为了确定原因，他们根据发出的荧光信号，将含有和不含mCherry的细胞分开，进行进一步分析。有趣的是，尽管他们发现非荧光细胞含有外源基因，但与荧光细胞相比，rtTA的表达要低得多。

　　基于这一观察，研究人员测试了补充rtTA表达是否会提高肌源性分化的效率。正如他们所假设的那样，rtTA的补充将分化效率从约40%提高到80%以上，这表明rtTA的表达可能是iPSC分化的瓶颈。

　　研究人员接下来检查了另一个可能影响转基因表达的因素:抗生素耐药性阳性选择标记。为了测试这一参数，他们用piggyBac系统中编码嘌呤霉素耐药的基因替换了新霉素耐药转基因。令人惊讶的是，即使这些细胞具有更少的puromycin耐药基因拷贝，它们不仅表达高水平的mCherry和rtTA，而且通过转换抗生素耐药性，表达荧光报告蛋白的细胞的相对比例也显著增加。

　　研究人员随后测试了这种开关是否会促进MYOD1的统一表达和肌源性分化。事实上，他们可重复地获得90%以上的分化效率，而不是使用嘌呤霉素抗性选择。

　　通过优化上述因子和其他参数，研究小组表明他们可以成功地将iPSCs分化为骨骼肌细胞，并且效率足够高，无需克隆评估和选择。有了这些新知识，研究人员可以采用类似的策略，用于生成各种细胞类型所需的其他分化方法，以进行可复制疾病建模和安全的细胞治疗。

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